Immunochemical methods for ciguatoxins detection in pacific herbivorous and carnivorous fish.

Publication Type  Conference Paper
Year of Publication  1999
Authors  Pauillac, S.; Sasaki, M.; Naar, J.; Inoue, A.; Branaa, P.; Cruchet, P.; Chinain, M.; Legrand, A-M.
Conference Name  Proceedings of the 5th Indo-Pacifique Fish Conference
Volume  759-73
Conference Start Date  1999
Publisher  Séret B & Sire JY (Eds), Soc Fr Ichtyol, Paris
Conference Location  Noumea (New Caledonia)
Abstract  

Un conjugué de l'albumine bovine (BSA) et de l'ovalbumine (OVA) avec un fragment synthétique JKLM de la CTX-1B, la plus puissante des ciguatoxines (CTXs), a été préparé. Les liaisons haptène-protéine porteuses ont été établies via le N-hydroxysuccinimide ester du fragment carboxylique, en présence d'un carbodiimide hydrosoluble. Les conjugués de la BSA et de l'OVA ont servi respectivement à l'immunisation de deux souris BALB/c et à l'analyse de leur réponse immunitaire par ELISA. Les titres en anticorps (Ac) mesurés par la technique de la dilution finale étaient autour de 1/16.000 dans les deux cas. La grande spécificité des Ac murins a été démontrée par ELISA de type indirect ou compétitif. Dans le format classique en plaques à 96 puits, les Ac n'ont pas réagi de manière significative avec la PbTx-3 et d'autres composés de nature polyéther mais ont présenté au contraire 133% de réaction croisée vis-à-vis de la CTX-1B. Des limites de détection pour JKLM et la CTX-1B de 50 et 30 picomoles respectivement ont été obtenues avec un antisérum dilué au 1/30.000. Une diminution de la concentration en Ac (dilution 1/50.000) a permis d'abaisser le seuil de détection à 7 picomoles de CTX-1B. La sensibilité de cette technique a pu encore être ramenée à 0,6 picomoles de fragment JKLM par utilisation d'un microtest ELISA réalisé en plaques de Terasaki. Un essai préliminaire d'évaluation de CTXs dans des extraits lipidiques bruts de poissons a fourni essentiellement la même sensibilité (7 picomoles) que lors des tests de détection de CTX-1B pure réalisés dans les mêmes conditions en plaques standard. En conclusion, le test ELISA compétitif décrit pourrait être amélioré pour permettre en routine le dosage direct des CTXs dans des extraits pisciaires.A conjugate of JKLM ring fragment, a carboxylic derivative of the right-hand tetracyclic terminus portion of CTX-1B, the most potent ciguatoxin (CTX), with two carrier proteins has been synthesized. Hapten-carrier amide linkages were promoted using the N-hydroxysuccinimide ester of the carboxylic fragment in the presence of a water-soluble carbodiimide according to standard condensation procedure. Bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) were respectively used for i.p. immunization of two BALB/c mice and antibody screening. Titers of both antisera as determined in an end-point titration ELISA format were found to be around 1/16,000. Mice polyclonal antibodies (PAbs) specificity was demonstrated either by indirect or by competitive inhibition ELISA. In the classical 96-well format, PAbs did not significantly cross-react with PbTx-3 or other related polyether structures but did show 133% cross-reaction with CTX-1B. With a 1/30,000 antiserum dilution, the lower limit of accurate JKLM ring fragment and CTX-1B determinations was respectively 50 and 30 picomoles. Decreasing the antibody concentration (1/50,000 dilution), allowed a detection limit of 7 picomoles CTX-1B. The sensitivity of the assay could be further lowered to 0.6 picomoles JKLM fragment by means of a microELISA format performed in Terasaki plates. A preliminary assessment of CTXs in crude lipid extracts of fish yielded the same sensitivity (7 picomoles) as found for detection of pure CTX-1B performed in the standard ELISA format under the same conditions. It was concluded that the competitive ELISA described herein could be developed into a routine screening method for the determination of pacific CTXs in crude fish extracts.

Exporter  Tagged XML BibTex