Epidémiologie moléculaire et évolution génétique virale intra- et inter-hôtes

• Historique et dynamique des épidémies de dengue en Polynésie française
  
  Chef de projet et intervenants : Dr Van Mai CAO LORMEAU, Claudine ROCHE, Jérôme VIALLON

  En Polynésie française, la première épidémie de dengue dont le sérotype a été clairement identifié était due au sérotype 1 (DEN-1) en 1944. Depuis, le Pays a connu onze épidémies de dengue. A partir du milieu des années 50, les données épidémiologiques, cliniques et virales, relatives à ces différentes épidémies, ont été enregistrées, archivées et parfois publiées, par l’ILM et plus particulièrement le Laboratoire de recherche en virologie médicale (LVM). La réalisation d’un historique de ces épidémies de dengue, ainsi que la compilation et le traitement des données enregistrées à l’ILM tout au long de ces années, en corrélation avec d’autres informations (notamment démographiques - Institut de la Statistique de Polynésie française), a contribué à l’identification de facteurs et d’événements qui caractérisent l’épidémiologie de la dengue en Polynésie française. Une publication est en cours.

  Poster : Lost in French Polynesia which stategies for a dengue virus to spread ? (ASTMH, 2007)
  

  En collaboration avec... E. DESCLOUX Dr S. LASTERE - ILM-LABM Dr A. WIEGANDT - Direction de la santé - Bureau des pathologies infectieuses (http://www.sante.gov.pf), actuellement Secrétariat de la communauté du Pacifique (Nouméa, Nouvelle-Calédonie) (axelW@spc.int)

• Identification de marqueurs moléculaires corrélés à la virulence et à l’atténuation de souches virales de dengue 3 isolées en Polynésie française

  Chef de projet et intervenants : Claudine ROCHE, Maite AUBRY (Stagiaire Master I - Université de Nice-Sofia Antipolis), Dr Van Mai CAO LORMEAU
  
  La Polynésie française a connu trois épidémies de DEN-3, en 1964, 1969 et 1989. Les deux premières épidémies, au cours desquelles ont été isolées des souches du génotype IV (génotype américain), ont entraîné exclusivement des formes cliniques bénignes (DF). Par contre, l’épidémie de 1989, qui a pour origine des souches du génotype I (génotype du sud-est asiatique et du Pacifique sud), a été qualifiée de sévère en raison de l’observation de nombreux cas graves (DH/DSC). Les génotypes II et III, isolés respectivement en Thaïlande et dans le sous-continent indien, ont également été impliqués dans des épidémies sévères. D’après ces observations, le génotype IV de DEN-3 peut être considéré comme celui présentant le potentiel de virulence le moins élevé.

  L’objet de notre étude est d’identifier les différences génétiques entre souches de DEN-3 de génotypes I et IV. Un intérêt majeur à la réalisation de cette étude avec des souches de Polynésie française est que les deux génotypes ont circulé dans le même contexte géographique, éco-biologique (climat, espèces vectorielles) et humain (faibles flux de population). Cette situation permet de réduire, au moins en partie, les biais liés au contexte et considérer que la différence épidémiologique majeure entre ces génotypes réside dans leur capacité à causer ou non des formes cliniques sévères. La comparaison des séquences de ces souches de DEN-3 devrait conduire à l’identification de séquences spécifiques du génotype IV, lesquelles pourraient être impliquées dans le potentiel de moindre virulence de ce génotype.

• Etude de la variabilité génomique des souches virales de dengue 1 ayant circulé en Polynésie française de 2001 à 2006
  
  Chef de projet et intervenants : Dr Van Mai CAO LORMEAU, Elodie DESCLOUX (Stagiaire Master II - Université Aix-Marseille II), Claudine ROCHE

  De février à novembre 2001, la Polynésie française a été le siège d’une importante épidémie de DEN-1. Après l’épidémie, le virus a continué à circuler dans le Pays avec une faible incidence. En juillet 2006, une nouvelle épidémie de DEN-1 a émergé et s’est s’étendue jusqu’en septembre 2007.

  L’objectif de cette étude était de déterminer l’origine, l’évolution et la variabilité génétique des souches de DEN-1 ayant circulé en Polynésie française de l’épidémie de 2001 à celle de 2006-07. La comparaison des séquences de la région codante complète et plus particulièrement du gène d’enveloppe (E) d’un certain nombre de souches nous a permis de confirmer que l’épidémie de 2006 était liée à la réémergence locale du génotype viral « endémisé » après l’épidémie de 2001. L’analyse des séquences, en corrélation avec les données temporelles et géographiques associées à chaque souche, a contribué à l’identification de certaines caractéristiques de l’évolution génétique du virus de la dengue dans le contexte polynésien.

  La diversité génétique virale ne s’exprime pas uniquement à l’échelle des populations (inter-hôtes), elle existe également à l’échelle de l’individu infecté (intra-hôte). Chez l’homme comme chez le vecteur, l’infection est le fait d’une population de virus génétiquement proches mais différents appelée quasi-espèce. Les séquences partielles du gène E de clones issus d’une dizaine de souches de DEN-1 ont été comparées. L’analyse de la structure de la population virale composant chacune de ces souches a été réalisée en corrélation avec différentes données, notamment cliniques et épidémiologiques. Une publication est en cours.

  En collaboration avec... Pr X. de LAMBALLERIE - Unité des virus émergents, UMR 190 IRD-Université Aix Marseille II Dr S. LASTERE - ILM-LABM

• Dynamique des populations virales de dengue: (i) in vivo dans le sang capillaire; (ii) in vitro sur lignées cellulaires de mammifère et de moustique

  Chef de projet et intervenants : Dr Van Mai CAO LORMEAU, Maite AUBRY (Stagiaire Master II - Université Aix-Marseille II), Claudine ROCHE
  
  Chez l’homme comme chez le moustique, le virus de la dengue existe sous la forme d’une population de virus génétiquement proches mais distincts communément appelée quasi-espèce. Au cours de l’infection chez l’homme, la population virale va être soumise à plusieurs contraintes : séquence de l’infection, tropisme cellulaire du virus, pression immunitaire humorale et cellulaire, autres (facteurs génétiques…). Du fait de ces contraintes, la population virale contenue dans le sang circulant est susceptible de varier au cours du temps. Chez le vecteur, à partir de l’ingestion du repas sanguin infectant et au cours de la dissémination virale dans les différents tissus du moustique, la population virale va également être soumise à différentes contraintes, notamment les barrières de l’estomac et des glandes salivaires.

  Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à la dynamique des populations virales de dengue chez l’homme, au cours de l’infection. Les séquences partielles du gène E, de populations virales issues du sang veineux et du sang capillaire d’un patient en phase aiguë de dengue, ont été comparées. La même analyse a ensuite été réalisée à partir de prélèvements de sang capillaire effectués à différents temps au cours de l’infection. L’objectif de cette étude était : de déterminer si les populations virales contenues dans le sang veineux et le sang capillaire sont identiques à un temps donné ; de déterminer si la population virale susceptible d’être prélevée par le vecteur varie au cours de la période infectante ; et d’identifier sur la région étudiée du gène E les sites fortement soumis à sélection durant la phase aiguë de la maladie.

  Dans un second temps, nous avons utilisé le prélèvement veineux d’un patient en début de phase aiguë d’infection et observé l’évolution de différentes régions génomiques virales dans la population, au cours de passages successifs ou alternés sur lignées cellulaires de moustique ou de mammifère. L’objectif de l’étude était de déterminer comment s’exercent les contraintes propres à chaque espèce-hôte sur le génome viral, puis d’évaluer l’impact de la combinaison des contraintes inhérentes aux deux espèces sur un modèle de culture cellulaire alternée.

  Inoculation du virus de la dengue aux cellules de moustique	Incubation des cellules en étuve à CO2
  En collaboration avec... Pr X. de LAMBALLERIE - Unité des virus émergents, UMR 190 IRD-Université Aix Marseille II Dr S. LASTERE - ILM-LABM Dr F. DEVAUD - Laboratoire d'analyses de l'hôpital de Raiatea

• La dengue ou la nécessité d’une recherche locale et coordonnée sur un problème de santé publique commun aux Territoires et Etats insulaires du Pacifique Sud
  (Le virus de la dengue dans le Pacifique Sud : épidémiologie moléculaire, évolution génétique et dynamique des quasi-espèces chez l’homme et le moustique vecteur)

  Chef de projet et intervenants : Dr Van Mai CAO LORMEAU, Maite AUBRY (Préparation sujet de thèse), Claudine ROCHE

  Au cours de la dernière décennie, parallèlement à l’accroissement des échanges touristiques et commerciaux, les Etats insulaires du Pacifique Sud ont été le siège d’épidémies de dengue en cascades. Devant l’échec des mesures de contrôle vectoriel sur le long terme et l’absence de vaccin disponible sur le marché, la mise en place d’une surveillance proactive et coordonnée de la dengue dans le Pacifique Sud est une nécessité. Comparé au nombre élevé d’études et de publications relatives à l’épidémiologie de la dengue dans les régions endémiques continentales (Asie du Sud-Est, Amérique du Sud), peu de données concernent le Pacifique Sud. Or, en raison de contextes géographique, éco-biologique et sociologique particuliers (insularité, climat, présence de moustiques vecteurs endémiques, faible densité et flux de population) le virus de la dengue serait soumis à des contraintes spécifiques dans les îles du Pacifique Sud.

  Le premier objectif du projet est de caractériser l’évolution génétique du virus de la dengue dans les îles du Pacifique Sud, en l’associant à différents facteurs : temporels, géographiques, écobiologiques (climat, vecteurs), épidémiologiques (période épidémique/inter-épidémique), cliniques… Cette étude contribuera à identifier les événements et les facteurs qui caractérisent l’épidémiologie de la dengue dans la région.

  Le second objectif est d’identifier les mécanismes et l’impact du jeu des pressions de sélection auquel est soumis le virus au cours de son cycle de transmission, chez l’homme et le moustique. Il s’agit de déterminer si la diversité génétique virale intra-hôte (quasi-espèces) peut être corrélée à la fois avec des facteurs propres à l’individu (notamment historique d’infection par le virus de la dengue et expression clinique de la maladie chez l’homme) et à l’espèce-hôte (mammifère, moustique). L’identification des mécanismes sur lesquels repose l’évolution génétique du virus de la dengue dans les îles du Pacifique Sud est une étape essentielle, dans la perspective de l’utilisation des premiers vaccins anti-dengue dans la région.

  En collaboration avec... Dr S. CHANTEAU - Institut Pasteur de Nouméa (Nouvelle-Calédonie) Pr J. AASKOV - WHO Collaborating Centre for Arbovirus Reference and Research, School of Life Sciences, Queensland University of Technology (Australie) Pr X. de LAMBALLERIE - Unité des virus émergents, UMR 190 IRD-Université Aix Marseille II Dr J.F. YVON - Laboratoire d’analyses de l’Hôpital de Sia (Wallis et Futuna) Dr S. LASTERE - ILM-LABM Financement Fonds Pacifique (Ministère des Affaires étrangères et européennes)

   Etude des interactions moléculaires «  virus/vecteur/hôte

Etude des interactions moléculaires «  virus/vecteur/hôte »

• Caractérisation moléculaire des protéines se liant au virus de la dengue dans les glandes salivaires de moustiques vecteurs (Ae. aegypti, Ae. polynesiensis)

  Chef de projet et intervenants : Dr Van Mai CAO LORMEAU, Vaea RICHARD, Jérôme VIALLON

  Le virus de la dengue est transmis par des moustiques du genre Aedes, principalement Aedes (Stegomyia) aegypti et des vecteurs endémiques, tel qu’Aedes polynesiensis dans le triangle polynésien. La transmission du virus, du moustique infecté à l’homme, a lieu au cours de la prise de repas sanguin par l’injection de salive infectante. En tant que lien unique et nécessaire entre le vecteur et l’hôte humain pour la transmission virale, la salive du moustique apparaît comme un élément-clé. Plusieurs études ont montré l’existence d’interactions entre la salive d’Ae. aegypti et la réponse immune de l’hôte, cependant le rôle de ces interactions sur l’établissement de l’infection par le virus de la dengue reste encore flou.

  Dans le cadre d’une précédente étude (V.M. Cao-Lormeau, Thèse 2006) nous avons détecté la présence de protéines capables de se lier aux quatre sérotypes de dengue dans les extraits de glandes salivaires d’Ae. aegypti et Ae. polynesiensis. La présente étude a pour objet d’identifier de façon plus précise les protéines précédemment détectées. L’identification de complexes formés entre le virus de la dengue et des protéines salivaires du moustique pourrait contribuer à la proposition d'hypothèses sur le rôle de la salive du vecteur sur l’établissement de l’infection. Dans le concept du « Surface Mosaïc World » la formation de complexes virus/protéine salivaire du vecteur détournerait la réponse immune de l’hôte à la faveur du virus, aux étapes précoces de l’infection.

  Poster : Dengue viruses binding proteins from Aedes mosquito salivary glands and C6/36 cells (ASTMH, 2006)

  En collaboration avec... Dr D.E. CHAMPAGNE - University of Georgia - Department of Entomology and Center for Tropical and Emerging Global Diseases (Athens, USA)

Standardisation d’outils moléculaires et études de séroprévalence pour une meilleure surveillance des arboviroses à risque épidémiologique pour la Polynésie française

• Surveillance entomologique et biologique de la dengue et autres arboviroses en Polynésie française

  Chef de projet et intervenants : Dr Van Mai CAO LORMEAU, Claudine ROCHE, Jérôme VIALLON

  Plusieurs facteurs, propres à la situation géographique particulière de la Polynésie française, contribuent à l’émergence régulière d’épidémies de dengue et constituent un risque pour l’introduction d’autres arbovirus. Ce programme a pour objectif l’amélioration des connaissances et la standardisation d’outils de détection pour la surveillance biologique et entomologique de la dengue et autres arboviroses en Polynésie française.

  Le présent programme de recherche se décline en quatre volets : (1) L’élaboration d’un protocole pour la détection du virus de la dengue par RT-PCR en temps réel dans le sérum de patients et dans des lots de moustiques ; (2) L’élaboration d’un protocole de RT-PCR universelles «  Flavivirus, Alphavirus, Phlébovirus » et de RT-PCR spécifiques pour les arbovirus à risque épidémiologique pour la région ; (3) La réalisation d’une étude de séroprévalence d’arboviroses autres que la dengue dans un échantillon de la population humaine de Polynésie française ; (4) L’évaluation des méthodes de capture et d’échantillonnage de moustiques.

  Sérums de patients	RT-PCR en temps réel
  En collaboration avec...  Dr M. GRANDADAM - Laboratoire associé au CNR des arbovirus, Unité de virologie tropicale, Institut de Médecine Tropicale du Service de Santé des Armées (Marseille)    S. LONCKE - Centre d'hygiène et de salubrité publique Dr H. BOSSIN - ILM-LEM Dr S. LASTERE - ILM-LABM   Financement Ministère de l’Outre-Mer

Etude de la pathogenèse des formes sévères de dengue chez l’homme

• Immunité cellulaire anti-dengue mémoire et formes sévères
  Chef de projet hors ILM et intervenants ILM : Dr Allison IMRIE (University of Hawaii at Manoa, Hawaii), Claudine ROCHE, Dr Van Mai CAO LORMEAU
  

  L’altération de la réponse cellulaire T mémoire au cours d’infections secondaires par un sérotype de dengue différent de la primo-infection est l’une des hypothèses avancées pour expliquer l’apparition de formes cliniques sévères. L’étude de la réponse cellulaire T mémoire anti-dengue, vis-à-vis de sérotypes hétérologues, implique l’utilisation des lymphocytes T de personnes dont la chronologie des infections par les différents sérotypes de dengue est connue. En Polynésie française, la co-circulation de différents sérotypes de dengue n’a jamais été détectée au-delà de quelques semaines. Cette situation épidémiologique particulière permet d’étudier les réponses immunitaires consécutives à une infection par un sérotype donné, sans que cet effet soit masqué par des infections endémiques par les 3 autres sérotypes de dengue. La réactivité des lymphocytes T (cytolyse et profils cytokiniques) de patients de Polynésie française, dont l’historique de dengue est connu, sera mesurée in vitro après stimulation par des antigènes viraux de sérotype identique ou différent des infections antérieures. Cette étude complète des résultats préliminaires obtenus sur quelques patients hawaiiens originaires de Tahiti.

  Prélèvement de sang veineux

  En collaboration avec... Dr NL NGUYEN - ILM-CIE