Doctorat en Sciences de l'Environnement marin - Université Aix-Marseille II (France), 139 p.
Abstract
Dans l'optique d'une détection immunochimique des toxines de la ciguatéra, uenétude sur la formation de conjugués immunogènes haptène lipidique-protéine porteuse a été réalisée. Des travaux antérieurs ayant montré le rôle essentiel d'une forte épitopique pour l'obtention d'anticorps spécifiques et de bonne affinité, nous avons recherché à l'aide de molécules modèles, une nouvelle technologie de préparation de tels conjugués compatible avec l'utilisation de micro-quantité de toxine purifiée. Pour cette étude, trois molécules modèles, l'acide acétyl benzoïque (ABA), l'hémisuccinate de cholestérol et une brévétoxine : la PbTx-3, ont été utilisées.
L'ABA a été choisi pour son hydrophobicité comparable à celle des CTXs, son faible coût et sa relative facilité d'analyse alors que le cholestérol, en plus d'un caractère hydrophobe prononcé, présente comme la CTX1B une fonction hydroxyle. Enfin la PbTx-3, parce qu'elle possède une structure chimique et une activité biologique très proche de celles des ciguatoxines, représente le modèle d'étude par excellence. Enfin, l'absence d'un test de surveillance commercialisé de la salubrité des coquillages vis à vis des intoxications neurologiques par les fruits de mer et d'anticorps monoclonaux dirigés contre les brévétoxines, permet d'introduire une composante valorisable à cette étude.
Le développement de milieux réactionnels micro-hétérogènes, les milieux micellaires inversés, ont permis d'établir les conditions de conjugaison optimales pour l'obtention de conjugués fortement substitués. Dans certaines conditions ces milieux favorisent la conjugaison entre la protéine hydrophile et l'haptène lipidique, en concentrant les réactifs dans des micro-vésicules. La transformation des composés hydroxylés en leur dérivé succinylé a aussi été étudiée et miniaturisée. Cette transformation présente un rendement de 100% à partir de très faibles quantités d'haptènes. la transformation de 400 μg de PbTx-3 en son dérivé mono-succinylé et sa conjugaison ultérieure à la sérum albumine bovine puis, après récupération de l'excès de réactifs non couplé, à l'ovalbumine a permis d'induire et de caractériser des réponses polyclonales aussi bien chez des souris que chez un lapin. Après fusion des spiénocytes avec des cellules myélomateuses, deux lignées d'hybridomes produisant des anticorps spécifiques ont été isolées. L'anticorps monoclonal 1A11 reconnaît l'ensemble des brévétoxines de type 2 et permet, dans un format ELISA de type compétitif, d'appréhender de très faibles quantités de toxines pures et pourra faire l'objet d'études plus approfondies pour son incorporation dans un test de détection immunochimique. L'ensemble de la technologie pourra être appliqué à la préparation d'anticorps spécifiques d'haptènes lipidiques hydroxylés très faiblement disponibes comme le sont les CTXs.