La PCR
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La PCR est une technique de biologie moléculaire mise au point en 1985, par Karry Mullis. C'est une technique d'amplification génique, c'est-à-dire qu'elle permet de repérer un fragment d'ADN ou de gène précis, même présent en quantité infime dans un mélange, puis de le multiplier rapidement. |
Auparavant, une telle opération nécessitait impérativement le clonage de la séquence, son isolement, son amplification dans une cellule hôte et sa purification. Cette méthode extrêmement lourde et longue a été dès que possible abandonnée au profit de la PCR qui a certainement connu le développement le plus spectaculaire et le plus rapide dans l'histoire de la biologie.
En effet, moins de 3 ans après sa mise au point, l’ensemble des laboratoires de biologie moléculaire l'utilisaient.
Le principe de la PCR
Le principe de la PCR consiste à utiliser, de manière répétitive, l'une des propriétés des ADN polymérases : celle de ne pouvoir synthétiser un brin complémentaire d'ADN qu'à partir d'une amorce.
Les acteurs de la PCR |
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La réaction
Une réaction de PCR correspond à la succession d'une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes :
- Dénaturation
- Hybridation
- Elongation
Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un tube qui sera soumis aux différentes températures correspondant à chaque étape. Ces cycles de température sont réalisés automatiquement dans un thermocycleur.
Que se passe-t-il à chaque étape ?
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Que se passe-t-il à chaque cycle ?
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Au fil des cycles la quantité d'amplicons va augmenter de façon exponentielle. On obtient, en théorie 2n copies pour n cycles. Dans la pratique, pour un rendement classique de 85%, une PCR de 30 cycles produit environ 106 copies (amplicons de taille attendue).
Comment visualiser les produits d'amplification ?Leur quantité est suffisante pour être visualisée avec le Bromure d'Ethidium (BEt), produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques. Lorsqu'elle est intercalée, cette molécule présente une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 300 nm). Les produits d'amplification sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BEt. La vitesse de migration étant dépendante de la masse moléculaire, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des amplicons pourront être vérifiées. |
Electrophorèse
en gel d'agarose |
Les applications de la PCRLes applications sont trop nombreuses pour être toutes citées. Elles consistent toujours à rendre décelable, et de ce fait analysable, de l'ADN, souvent présent à l'état de traces. On retiendra deux grands axes : Les applications directes
Les applications indirectesIl s'agit de recherches effectuées sur les produits d'amplification qui servent de base à l'application d'une seconde technique : le séquençage direct ou des techniques susceptibles de faire apparaître une différence de comportement entre ADN normal et ADN « muté ». Cela permet, par exemple, la mise en évidence et la caractérisation de mutations inconnues. |
La technique PCR : une révolution méthodologique
Grâce à son universalité, la PCR a conquis une place prépondérante en biologie moléculaire et concerne en particulier, tous les aspects de la biologie moléculaire appliquée à la médecine. Son apparition a représenté un progrès méthodologique décisif.
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