De la dengue et de ses vecteurs - Virus
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Le virus
L’agent étiologique de la dengue est un Flavivirus de la famille des Flaviviridae transmis par des moustiques du genre Aedes. Il existe quatre sérotypes de dengue (DEN1, DEN2, DEN3 et DEN4), lesquels sont sérologiquement liés mais antigéniquement distincts. Chaque sérotype comprend une variété de sous-types classés par l’analyse phylogénétique de leur génome, essentiellement des parties ou la totalité de la séquence du gène d’enveloppe E (Trent et al., 1990; Rico-Hesse, 1990; Deubel et al., 1990; Chungue et al., 1993; Chungue et al., 1995). L’infection par le virus de la dengue induit une immunité durable contre le sérotype infectant, mais il n’y a pas d’immunité croisée à long terme contre les autres sérotypes.
La structure du virus de la dengue
Comme tous les Flaviviridae, le virus de la dengue est un virus enveloppé, de structure icosaédrique et d’un diamètre d’environ 50 nanomètres (Murphy, 1980). Son enveloppe est une bicouche lipidique dérivée de la cellule-hôte, dans laquelle sont ancrées deux glycoprotéines structurales virales, la protéine d’enveloppe (E) et la protéine de membrane (M) (Lindenbach & Rice, 2001). Son génome est contenu dans une nucléocapside de structure icosaédrique, composée d’une troisième protéine structurale, la protéine de capside (C). Le génome du virus de la dengue (Fig.3A) est un ARN monocaténaire, linéaire, non-segmenté, de polarité positive et d’environ 11 kilobases (kb). Cet ARN génomique possède une coiffe de type I (m7GpppA) à son extrémité 5’ et aucune queue poly(A) à son extrémité 3’ (Wengler & Wengler, 1981; Brinton et al., 1986; Brinton & Disposito, 1988). Il ne présente qu’une seule phase ouverte de lecture (Fig.3B), laquelle code pour une polyprotéine unique (Zhao et al., 1986; Deubel et al., 1986, 1988; Mackow et al., 1987; Osatomi & Sumiyoshi, 1990; Fu et al., 1992). Le précurseur polyprotéique est clivé, co- et post-traductionnellement, par des protéases virales et cellulaires (Svitkin et al., 1984; Biedrzycka et al., 1987; Markoff, 1989; Nowak et al., 1989; Cahour et al., 1992). Ce clivage donne naissance à trois protéines structurales (C, prM, E) et sept protéines non-structurales (NS1, NS2a et b, NS3, NS4a et b, NS5) (Chambers et al., 1990a, 1990b, 1990c).
A 
B
Figure 3 - Le virus de la dengue. A) Organisation structurale; B) Organisation génomique
Les protéines virales
La protéine C est une petite protéine, riche en résidus lysine et arginine et, de ce fait, fortement chargée positivement. Par cette propriété, cette protéine neutraliserait les charges négatives de la molécule d’ARN virale, à laquelle elle est associée (Rice et al., 1985; Ma et al., 2004). Elle jouerait également un rôle essentiel dans l’assemblage des nouveaux virions, en assurant, avec la participation de protéines non-structurales, l’encapsidation de l’ARN génomique viral (Ferlenghi et al., 2001; Kummerer & Rice, 2002).
Deux formes de la glycoprotéine M ont été caractérisées : prM, contenue dans les virions intracellulaires immatures et précurseur de la protéine structurale M ; et la protéine M, contenue dans les virions extracellulaires matures. Dans les virions immatures, qui se forment au niveau du réticulum endoplasmique (RE) puis migrent vers l’appareil de Golgi, le précurseur prM est associé avec la protéine d’enveloppe E. Au sein de cet hétérodimère prM/E, prM jouerait le rôle d’une protéine chaperon, en empêchant l’environnement acide des compartiments de la voie de sécrétion d’induire des changements conformationnels irréversibles de la protéine E (Heinz et al., 1994a, 1994b). Peu avant la libération des particules virales, une protéase cellulaire de type furine assurerait ensuite le clivage de prM en M au niveau du réseau trans-golgien (Stadler et al., 1997). Pour plusieurs flavivirus, il a été démontré que le clivage de prM en M assure l’infectiosité de la particule virale. Sur des cultures de cellules de moustique, Guirakhoo et al. (1991) ont démontré que seuls les virions matures sont capables de réaliser le processus de fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire. L’absence de clivage de prM en M empêcherait les changements nécessaires à l’activité de fusion de la protéine E. Néanmoins, dans le cas de la dengue en particulier, il a été démontré que certains types cellulaires libèrent des particules virales contenant une forte proportion de prM et, pourtant, infectieuses (Randolph & Stollar, 1990; Murray et al., 1993; He et al., 1995).
La glycoprotéine E est le composant protéique majeur de la surface virale. Elle est impliquée, à la fois, dans les processus d’attachement et d’entrée du virus dans la cellule (Rice, 1996; Chen et al., 1996; Hung et al., 1999; Crill and Roehrig, 2001; Lozach et al., 2005). Deux sites potentiels de N-glycosylation sont conservés parmi les protéines E des quatre sérotypes de dengue : l’asparagine en position 153 (Asn-153), conservée chez tous les flavivirus, et l’Asn-67, propre au virus de la dengue. Les protéines E des virus DEN2 et DEN4 sont glycosylées uniquement sur l’Asn-67, alors que celles des virus DEN1 et DEN3 sont glycosylées sur les deux sites (Johnson et al., 1994). La glycosylation de ces sites jouerait un rôle dans l’attachement et l’entrée du virus dans la cellule (Guirakhoo et al., 1993; Hung et al., 1999; Navarro-Sanchez et al., 2003; Tassaneetrithep et al., 2003; Lozach et al., 2005). La protéine E fait partie des protéines de fusion de classe II (Lescar et al., 2001). Ces protéines sont associées en hétérodimères et présentent une séquence signal interne de fusion (peptide de fusion interne), dont l’exposition nécessite le clivage de la protéine « accompagnatrice » (Heinz & Allison, 2000; Kielian et al., 2000). Dans les virions immatures formés au niveau du RE, la protéine E est associée en hétérodimère avec prM. Puis, au niveau du réseau trans-golgien, le clivage de prM en M aboutit à la réorganisation oligomérique de la protéine E, laquelle s’associe en homodimères E/E dans les virions matures (Rey et al., 1995; Kuhn et al., 2002; Rey, 2003). Lors de l’infection de nouvelles cellules, l’acidification de l’endosome induit le réarrangement des dimères E/E en trimères E/E/E (Allison et al., 1995) à la surface du virion. Ce réarrangement aboutit à l’exposition du peptide de fusion interne, lequel interagit avec la membrane endosomale pour initier le processus de fusion (Heinz et al., 2004; Modis et al., 2004).
La glycoprotéine NS1 présente au moins un site de N-glycosylation (en position 208 ou 209) et 12 résidus cystéines, conservés chez tous les flavivirus. D’après des études réalisées sur la protéine NS1 du virus DEN1, la N-glycosylation jouerait un rôle dans la maturation et la sécrétion de la protéine (Flamand et al., 1999). La protéine NS1 existe sous différentes formes, soluble ou associée aux membranes cellulaires. Bien qu’elle ne semble posséder aucun motif d’ancrage, sous forme d’homodimère elle est capable de s‘associer aux membranes cellulaires (Winkler et al., 1988, 1989). La dimérisation de NS1 est également nécessaire à son export le long de la voie de sécrétion, du RE vers la membrane plasmique (Pryor & Wright, 1993). Une partie des protéines NS1 issues de la voie de sécrétion reste ensuite associée à la membrane plasmique, à la surface de la cellule infectée (Gould et al., 1985; Westaway & Goodman,1987; Schlesinger et al., 1990). Une autre partie est libérée dans le milieu extracellulaire, tel que cela a pu être démontré sur des cellules de mammifères en culture mais pas sur la lignée cellulaire de moustique C6/36 (Mason, 1989; Winkler et al., 1989). Dans le milieu extracellulaire, la protéine NS1 peut être trouvée sous forme soluble, organisée en oligomères (Crooks et al., 1990, 1994; Flamand et al., 1999), ou associée avec des microparticules (Mason, 1989; Lee et al., 1989, 1991; Falconar et al., 1990; Fan & Mason, 1990). Une forme circulante de NS1 peut être détectée dans le sérum de patients infectés par le virus de la dengue (Falconar, 1997). Dans la mesure où elle est associée avec la protéine E immature dans le RE, la forme intracellulaire de NS1 jouerait un rôle dans la maturation des virions, (Fan & Mason, 1990). Elle serait également impliquée dans les étapes précoces de la réplication virale (Mackenzie et al., 1996; Muylaert et al., 1996, 1997; Lindenbach & Rice, 1997; Westaway et al., 1997), mais son rôle est encore flou.
La protéine NS3 est une protéine hautement conservée parmi les flavivirus. En association avec la protéine NS2b, la partie N-terminale de NS3 agit comme une sérine protéase (30% de la séquence totale), et serait impliquée dans le clivage de plusieurs protéines virales (Bazan & Fletterick, 1989; Preugschat et al., 1990; Falgout et al., 1991). La partie C-terminale porte, quant à elle, des motifs caractéristiques de la superfamille des ARN hélicases (Gorbalenya et al., 1989). Des protéines recombinantes contenant le domaine hélicase de la protéine NS3 présentent, à la fois, une activité nucléoside triphosphatase (NTPase) et une activité ARN hélicase (Cui et al., 1998; Li et al., 1999). La partie C-terminale de NS3 serait également impliquée dans l’ajout de la coiffe et la méthylation de l’ARN viral (Wengler & Wengler, 1993). Enfin, un clivage autoprotéolytique de NS3, dans son domaine hélicase, aurait un effet régulateur sur la réplication de l’ARN viral (Arias et al., 1993). Au sein du complexe de réplication de l’ARN viral, la protéine NS3 interagit, à la fois, avec l’ARN-polymérase ARN-dépendante NS5 (Kapoor et al., 1995) et avec la région 3’ non-codante de l’ARN génomique viral. Elle jouerait un rôle dans l’initiation de la synthèse du brin négatif d’ARN (Chen et al., 1997).
La protéine NS5 est une protéine également hautement conservée parmi les flavivirus. Dans sa partie C-terminale, la protéine NS5 présente une activité ARN-polymérase ARN-dépendante (Tan et al., 1996; Guyatt et al., 2001). Bien qu’aucune fonction particulière n’ait pu être attribuée à la partie N-terminale de la protéine NS5, elle porte dans sa séquence des motifs conservés chez certaines méthyltransférases et pourrait être impliquée dans l’ajout de la coiffe sur l’ARN viral (Koonin, 1993).
Bien que les quatre petites protéines non-structurales NS2a, NS2b, NS4a et NS4b présentent des séquences variables, leur caractère hydrophobe est conservé parmi les flavivirus, ce qui suggère l’association de ces protéines aux membranes cellulaires (Chambers et al., 1990c). La protéine NS2a semble jouer un rôle dans la maturation de la région C-terminale de NS1 (Falgout & Lai, 1989). La protéine NS2b s’associe avec NS3 pour former un complexe présentant une activité sérine protéase. Elle possède un domaine hydrophile d’une quarantaine d’acides aminés, nécessaire à l’activité protéasique du complexe NS2b-NS3 (Falgout et al., 1993; Lai et al., 1994). Les fonctions biologiques des protéines NS4a et NS4b n’ont été que très récemment précisées. Le tout premier rôle qui leur a été attribué était de contribuer à la localisation membranaire du complexe de réplication (Chambers et al., 1990b; Wengler et al., 1990). Cependant, une étude récente a démontré que la protéine NS4b, et dans une moindre mesure NS4a et NS2a, sont capables de bloquer les voies de réponse aux interférons (IFNs), des éléments clés de la réponse anti-virale innée. Sur une lignée cellulaire de reins de singe Rhésus, (LLC-MK2), Munoz-Jordan et al. (2003) ont analysé la capacité individuelle de plusieurs protéines du virus DEN2 à bloquer le système INF. Ils ont observé que la présence de la protéine NS4b (de même que l’infection par le virus de la dengue) bloque les voies de réponse à la fois à l’IFN-β (IFN de type I) et à l’IFN-γ(IFN de type II, suggérant que la cible de cette inhibition est un élément commun aux deux voies de transduction (le facteur de transcription STAT1). Ils ont également observé que les protéines NS4a et NS2a potentialisent l’effet inhibiteurde NS4b, mais n’ont qu’un effet inhibiteur réduit individuellement. D’après leurs résultats, NS4b pourrait jouer un rôle important dans la résistance de virus de la dengue aux INFs. Dans une autre étude, réalisée sur des lignées cellulaires humaines (K-562, THP1) transfectées de façon stable avec des réplicons d’ARN (ARN subgénomique autoréplicatif) exprimant toutes les protéines non-structurales, Jones et al. (2005) ont observé que la présence des réplicons inhibe la voie de réponse à l’INF-α (IFN de type I), mais pas celle à l’INF-γ. D’après leurs résultats, dans les cellules humaines, le virus de la dengue interfèrerait avec la voie de réponse à l’INF-α en bloquant l’expression du facteur de transduction STAT2 (lequel n’intervient pas dans la voie de réponse à l’IFN-γ). Cependant dans leur étude, l’effet individuel de chacune des protéines non structurales, notamment NS4b, n’a pas été évalué.
Le cycle viral
Dans le cas d’une cellule de mammifère (Fig.4B), l’attachement du virus sur la surface cellulaire implique une interaction entre la protéine d’enveloppe E (Rice, 1996) et des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire (Chen et al., 1997). Un processus d’endocytose récepteur-dépendante conduit alors à l’internalisation de la particule virale dans une vésicule à clathrines (Ishak et al., 1988). L’acidification de l’endosome induit ensuite la fusion de l’enveloppe virale et de la membrane endosomale (Gollins & Porterfield, 1985; Heinz et al., 2004; Modis et al., 2004), libérant ainsi la nucléocapside dans le cytoplasme de la cellule cible.
Dans les lignées cellulaires de moustiques (Fig.4A), l’interaction du virus avec des récepteurs de la cellule-cible est immédiatement suivie de la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane plasmique (Hase et al., 1989; Barth, 1992).
Figure 4 - Schéma d’entrée du virus de la dengue dans les cellules (A) de moustique, (B) de mammifère
Dans le cas particulier de la lignée monocyte-macrophage (Fig.5), en primo-infection, le virus entre dans la cellule selon le modèle d’endocytose dépendant des récepteurs pour le virus (Moreno-Altamirano et al., 2002). Par contre, dans le cas d’une infection secondaire (seconde infection par le virus de la dengue, mais de sérotype différent du celui de la primo-infection), un autre mécanisme viendrait fortement potentialiser l’entrée du virus dans les cellules de cette lignée. Ce phénomène, appelé ADE (Antibody Dependent Enhancement), est lié à la présence d’anticorps hétérologues, induit par la primo-infection, et présents à des taux sub-neutralisants au cours de l’infection secondaire. Ces anticorps favoriseraient l’incorporation du virus dans ces cellules via un mécanisme d’endocytose dépendant de récepteurs pour le domaine Fc des IgG (FcγRI et FcγRII).
Quel que soit le type cellulaire, la libération de la nucléocapside dans le cytoplasme est suivie de la décapsidation de l’ARN génomique viral (Fig.6). Celui-ci fait office d’ARN messager (ARNm) traduit par des enzymes cellulaires en une polyprotéine virale, laquelle subit une série de clivages impliquant des protéases cellulaires et virales (Svitkin et al., 1984; Biedrzycka et al., 1987; Markoff, 1989; Nowak et al., 1989; Cahour et al., 1992). La maturation protéolytique de la polyprotéine virale, puis de ces produits de clivage, génère les trois protéines structurales et les sept protéines non-structurales. A côté de son rôle initial d’ARNm, l’ARN génomique viral de polarité positive (+) sert de matrice pour la réplication virale. Des protéines virales (notamment l’hélicase NS3 et l’ARN polymérase ARN-dépendante NS5) et probablement des protéines cellulaires forment un complexe de réplication réalisant la synthèse de brins d’ARN complémentaires (-). Ceux-ci servent à leur tour de matrice pour la synthèse de brins d’ARN (+) destinés soit à être traduits, soit à être encapsidés dans les virions en cours de maturation. Les brins d’ARN (+) constituent plus de 90% des ARN produits dans la cellule infectée. Les brins d’ARN (-) sont, quant à eux, essentiellement présents sous la forme d’intermédiaires réplicatifs double-brins, où ils servent de matrice à la synthèse des ARN (+). L’assemblage de la capside et l’encapsidation de l’ARN génomique viral se feraient à proximité du RE. Les nucléocapsides nouvellement formées seraient ensuite internalisées dans la lumière du RE selon un processus de bourgeonnement. La membrane du RE, dans laquelle sont ancrées les protéines E et prM, formerait ainsi l’enveloppe des virions immatures. Ces derniers seraient ensuite transportés, dans des vésicules de sécrétion, vers l’appareil de Golgi. Dans le réseau trans-golgien, il a été démontré qu’une protéase cellulaire assure la maturation de l’enveloppe virale par le clivage de prM en M. La libération des virions dans le milieu extracellulaire se ferait ensuite par exocytose au travers de la membrane plasmique (Mukhopadhyay et al., 2005).
Figure 6 - Cycle du virus de la dengue dans une cellule de mammifère. Adapté de Samuel, C.E (2002)
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